臭氧去除食品加工設(shè)備中的熒光假單胞菌生物膜的研究

食品加工環(huán)境和設(shè)備內(nèi)生物膜的形成增加了產(chǎn)品變質(zhì)和病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。就地清洗(CIP)操作在去除土壤和消毒處理設(shè)備(包括消除生物膜)方面非常有用。然而，CIP是一個(gè)資源密集型的過(guò)程，特別是在化學(xué)洗滌劑，熱和消毒劑的使用方面。本研究旨在探討將臭氧整合到CIP操作中的可行性，以促進(jìn)假單胞菌生物膜的消除，其長(zhǎng)期目標(biāo)是減少對(duì)傳統(tǒng)清潔和消毒試劑的依賴(lài)。為了研究臭氧與CIP的結(jié)合，在一個(gè)中試食品加工設(shè)備上，在10%脫脂牛奶(脫脂牛奶-水混合物，1:9 v/v)中培養(yǎng)2天，在靜止條件下培養(yǎng)出熒光假單胞菌，然后在添加10%新鮮脫脂牛奶的情況下再循環(huán)5天。CIP采用22-25℃水洗，50℃0.2%氫氧化鉀堿性清洗，很后用水沖洗。這些CIP操作將浮游細(xì)胞數(shù)量減少到低于檢測(cè)方法的極限，但并沒(méi)有從加工設(shè)備的光滑或粗糙表面完全去除熒光假單胞菌生物膜。當(dāng)CIP過(guò)程之后應(yīng)用含水臭氧步驟(10 ppm, 10分鐘)時(shí)，處理減少了光滑和粗糙表面的生物膜細(xì)胞數(shù)量，低于回收方法的檢測(cè)限(分別為0.9和1.4 log CFU/ 100 cm2)。這些結(jié)果證明了臭氧輔助CIP在去除加工設(shè)備上的微生物生物膜方面的效用，但需要進(jìn)一步研究以?xún)?yōu)化清洗劑的使用和臭氧的應(yīng)用。

1. 介紹

在食品加工環(huán)境中，對(duì)致病菌(如假單胞菌和單核增生李斯特菌)的控制一直是一個(gè)難點(diǎn)。在適當(dāng)?shù)乃趾蜖I(yíng)養(yǎng)條件下，這些細(xì)菌可以在食品加工設(shè)備上快速形成生物膜(Brooks and Flint, 2008)。由此產(chǎn)生的生物膜是食品重復(fù)污染的持續(xù)來(lái)源，這在很大程度上影響了產(chǎn)品的保質(zhì)期和安全性。事實(shí)上，生物膜在食品行業(yè)，特別是乳制品行業(yè)中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究(Panebianco等人，2022)，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以在乳制品加工操作的幾個(gè)環(huán)節(jié)和加工設(shè)備的許多部分形成生物膜(Marchand等人，2012)。變質(zhì)微生物如假單胞菌的生物膜被認(rèn)為是乳品加工操作中的一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。假單胞菌屬的成員無(wú)處不在，經(jīng)常從乳制品生產(chǎn)設(shè)備或乳制品中分離出來(lái)。假單胞菌產(chǎn)生耐熱脂肪酶和蛋白酶，這些酶在牛奶熱處理后會(huì)持續(xù)存在，從而通過(guò)產(chǎn)生不良風(fēng)味和氣味導(dǎo)致很終產(chǎn)品變質(zhì)(Zhang等人，2019)(Reichler等人，2021)。幾種假單胞菌通常從乳制品工廠分離出來(lái);其中包括熒光假單胞菌、fragi假單胞菌、惡臭假單胞菌、嗜蟲(chóng)假單胞菌和銅綠假單胞菌(Chiesa et al.， 2014)。

就地清洗(CIP)操作旨在通過(guò)盡量減少加工過(guò)程中的產(chǎn)品再污染來(lái)確保加工食品的安全(Seiberling, 1997)。CIP系統(tǒng)去除設(shè)備內(nèi)部表面沉積的材料，無(wú)需打開(kāi)或拆卸設(shè)備，很少或根本不需要人工操作(Smithers, 2022)。傳統(tǒng)的CIP操作在去除食品接觸面上形成的生物膜的效果上各不相同(Dufour等，2004)。這種操作通常由以下步驟組成:(1)用水沖洗;(2)堿清洗，或不加酸洗;(3)衛(wèi)生處理。消毒步驟的設(shè)計(jì)是為了保持設(shè)備足夠的衛(wèi)生條件。這一步驟通常涉及使用殺菌劑，包括氯、過(guò)氧乙酸、碘劑或季銨化合物(Joseph et al.， 2001)。然而，處于生物膜狀態(tài)的細(xì)菌可以對(duì)這些殺菌劑的抗菌作用產(chǎn)生保護(hù)作用(Srey et al.， 2013;Wassenaar et al.， 2015)。大量使用這些殺菌劑可能會(huì)對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生負(fù)面影響，并導(dǎo)致加工設(shè)備惡化(Marino et al.， 2018)。作為一種替代消毒劑，臭氧在食品工業(yè)中已被廣泛應(yīng)用，并被批準(zhǔn)用于食品處理、儲(chǔ)存和加工(食品和藥物管理局，2001年)。臭氧的特點(diǎn)是對(duì)許多致病性和腐敗微生物具有很強(qiáng)的抗菌活性，并因其對(duì)環(huán)境的影響很小而被認(rèn)為是一種環(huán)保消毒劑(Pascual等人，2007;Marino et al.， 2018;Masotti等人，2019;Bigi et al.， 2021)。臭氧通過(guò)多種機(jī)制破壞微生物的細(xì)胞質(zhì)膜和其他細(xì)胞成分，包括氧化不飽和脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，從而使微生物失活(Khadre et al.， 2001)。臭氧還可以阻止微生物細(xì)胞與表面的初始附著，并通過(guò)破壞參與細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)抑制生物膜的形成(Panebianco et al.， 2022)。

假單胞菌在加工環(huán)境中形成生物膜是食品工業(yè)中一個(gè)相當(dāng)大的問(wèn)題，它可能導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)和疾病爆發(fā)(Srey等人，2013)。關(guān)于假單胞菌生物膜在工業(yè)環(huán)境下的生成和臭氧對(duì)這種生物膜的使用的系統(tǒng)研究是缺乏的。因此，本研究的目的是:(1)研究當(dāng)脫脂牛奶(乳制品的一個(gè)例子)作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源時(shí)，熒光桿菌在中試規(guī)模的食品加工設(shè)備上形成堅(jiān)固的生物膜的能力;(2)評(píng)估在CIP凈化過(guò)程中使用臭氧作為消毒劑的生物膜控制技術(shù)的效果。

2. 材料與方法

2.1. 臭氧輔助就地清洗系統(tǒng)

臭氧輔助CIP系統(tǒng)(圖1)是俄亥俄州立大學(xué)的研究人員和一家臭氧設(shè)備制造商(Del ozone, San Luis Obispo, CA)合作為本研究定制的。該系統(tǒng)(圖1)由一個(gè)132升的容器(用于存放漂洗水)，三個(gè)57升的容器(用于存放堿性溶液，酸性溶液和消毒劑)，一個(gè)熱交換器(型號(hào):STFT-6000-240;TruHeat, Richmond Hill, ON, Canada)，一個(gè)泵，以及測(cè)量湍流，溫度，pH值和電導(dǎo)率的儀表。離心泵(Gould離心泵，型號(hào)NPE 1ST1F5B6, Seneca Falls, NY)用于將CIP流體循環(huán)到中試規(guī)模的食品加工設(shè)備，并由GS AC Drive (Automation Direct, Cumming, GA)調(diào)節(jié)。監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)采集使用兩個(gè)流量計(jì)(Blue-White Industries F-1000, Huntington Beach, CA)，兩個(gè)熱電偶(Omega, Stamford, CT)，一個(gè)pH計(jì)(Jenco Instr。(Emerson/Rosemount Analytical Model 1056 Dual Input Analyzer, Shakopee, MN)，兩個(gè)電導(dǎo)率探頭(Emerson)。這些探頭被放置在CIP系統(tǒng)的入口和返回線中，與加工設(shè)備相關(guān)。CIP設(shè)備的設(shè)置方式是，通過(guò)打開(kāi)適當(dāng)?shù)拈y門(mén)，CIP泵可以從任何單個(gè)容器(水，堿性，酸性或消毒劑)中抽出流體，并通過(guò)噴霧球?qū)⒘黧w引導(dǎo)到加工設(shè)備;然后，水流將流經(jīng)所有的加工生產(chǎn)線，并將水返回到啟動(dòng)水箱，或者簡(jiǎn)單地通過(guò)加熱器將水再循環(huán)并返回到水箱以控制溫度。臭氧衛(wèi)生系統(tǒng)(Del ozone AGW 4045)具有內(nèi)置臭氧發(fā)生器和控制器(Del ozone Genesis CD-45GV)，與CIP系統(tǒng)集成在一起?；宓某粞醪糠钟凶约旱难h(huán)回路，帶有第二個(gè)泵(型號(hào):NPE 1ST1F1B4，古爾德泵)，在使用過(guò)程中不斷產(chǎn)生和維持臭氧化水。臭氧系統(tǒng)的設(shè)置使CIP泵可以從主臭氧水罐中抽取水。

圖1.代表與臭氧發(fā)生器集成并結(jié)合中試規(guī)模食品加工設(shè)備的中試規(guī)模原位清洗系統(tǒng)。

2.2. 中試食品加工設(shè)備

CIP系統(tǒng)連接到模擬食品加工設(shè)備的中試裝置上，該設(shè)備由304級(jí)不銹鋼制成(圖2)。加工設(shè)備的構(gòu)造便于在清洗過(guò)程中連接到CIP系統(tǒng)。加工設(shè)備包括:(a) 190-L的罐(容器)，(b)放置在較大管道內(nèi)的填料閥，(c)管三通，(d)旁通管線，(e)四個(gè)小管段(內(nèi)徑2.54 cm，長(zhǎng)5.08 cm，內(nèi)表面積40.5 cm2)，使用粗砂碳化硅球筒磨具(Brush Research manufacturing, CA)人工制造表面粗糙的管段，(f)四個(gè)90°彎頭(內(nèi)徑2.54 cm，內(nèi)表面積117.0 cm2)，表面光滑，(g)回流泵(古爾德泵)，型號(hào)NPE 1ST1C5E6)，和(h) 7.6米(25英尺)的2.54厘米直徑管。

圖2.實(shí)驗(yàn)裝置的表示，包括用于污染中試規(guī)模加工設(shè)備和在不銹鋼表面上開(kāi)發(fā)乳品生物膜的結(jié)垢系統(tǒng)。污垢設(shè)備由以下部分組成，如圖所示：（1）19-L高密度聚乙烯容器，（2）帶4.8毫米穿孔的內(nèi)部過(guò)濾器，（3）在線路上的三個(gè)外部過(guò)濾器，網(wǎng)孔尺寸為20，40和40，（4）循環(huán)蠕動(dòng)泵，（5）進(jìn)料管路蠕動(dòng)泵，（6）5-L進(jìn)料瓶， （7）插入氯丁橡膠管的小不銹鋼管。加工設(shè)備的組成包括：不銹鋼T型管（8），旁通閥（9），填料（10），旁通管（11），四個(gè)粗糙表面管段（12）和四個(gè)光滑表面90°彎頭（13）。

2.3. 污染系統(tǒng)

所需的實(shí)驗(yàn)生物膜需要是堅(jiān)固的，并模擬當(dāng)食品加工設(shè)備的清潔被忽視或效率低下時(shí)自然會(huì)發(fā)生的情況。為了使研究易于管理和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)，生物膜在7天的過(guò)程中生成。為了生成這種生物膜，研究人員開(kāi)發(fā)了一種污染系統(tǒng)，該系統(tǒng)由一個(gè)19-L高密度聚乙烯容器組成，該容器可容納7.6 L接種的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后在系統(tǒng)中緩慢循環(huán)。該設(shè)備有一個(gè)四步過(guò)濾系統(tǒng)，可以在流體流到達(dá)泵之前將較大的顆粒從流體流中去除。第一個(gè)過(guò)濾器作為吸力過(guò)濾器放置在容器內(nèi)(4.8 mm穿孔;麥克馬斯特-卡爾，哥倫布市，俄亥俄州)。其他三種過(guò)濾器(濾網(wǎng)尺寸分別為20、40、40;麥克馬斯特-卡爾)是外部的容器，設(shè)計(jì)用于在污染運(yùn)行過(guò)程中拆卸和清潔，而無(wú)需拆卸整個(gè)系統(tǒng)或排水。通過(guò)過(guò)濾器后，流體進(jìn)入蠕動(dòng)泵(Masterflex型號(hào):7553-70;Masterflex頭型號(hào):7015;Barrington, IL)，它被指定為“循環(huán)泵”，通過(guò)目標(biāo)處理設(shè)備部件傳輸污染流體(圖2)。第二個(gè)5-L儲(chǔ)液器包含滅菌介質(zhì)，連接到第二個(gè)蠕動(dòng)泵(Masterflex型號(hào):7521-50;機(jī)頭型號(hào):7016;Masterflex)被綁在污染系統(tǒng)的輸入線上，慢慢地添加新鮮培養(yǎng)基，以保持生物體在多天的孵化中生長(zhǎng)。污垢系統(tǒng)包含多個(gè)小的不銹鋼管(每根內(nèi)徑為6.35 mm，長(zhǎng)9.05 mm，內(nèi)表面積為3.78 cm2)插入壬二烯管(06402-15;科爾·帕默，弗農(nóng)山莊，伊利諾伊州);這些試管用于檢測(cè)熒光假單胞菌污染期間生物膜形成的穩(wěn)健性。

2.4. 熒光假單胞菌培養(yǎng)物的制備

熒光假單胞菌ATCC 25289來(lái)自俄亥俄州立大學(xué)(Columbus, OH)微生物系的培養(yǎng)標(biāo)本。將細(xì)菌的冷凍培養(yǎng)基傳代于胰酶豆湯(TSB;Becton Dickinson & Co.， Sparks, MD)，并在搖床培養(yǎng)箱(New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ)中輕度攪拌，在30°C下孵育48小時(shí)。將熒光假單胞菌培養(yǎng)物鋪在胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上;Becton Dickinson & Co.)，在環(huán)境溫度(22-25°C)下孵育48小時(shí)，然后在TSB中傳代，然后用于實(shí)驗(yàn)(Meyer和Abdallah, 1978)。

2.5. 熒光假單胞菌生物膜發(fā)育

為了誘導(dǎo)生物膜的形成，在7.6 l容量的污染系統(tǒng)中進(jìn)行如下操作。脫脂牛奶(Kroger Co.， Cincinnati, OH)， 760 mL，用蒸餾水稀釋至總積7.6 L，然后在121°C高壓滅菌30分鐘;這將被稱(chēng)為“生物膜培養(yǎng)基”。生物膜培養(yǎng)基冷卻至室溫(22-25℃)后，接種38 mL (0.5% v/v) P. fluorescens ATCC 25289培養(yǎng)物。接種的生物膜培養(yǎng)基在循環(huán)中循環(huán)30 min，停滯2 d，然后以1.5 ~ 2.0 L/h的速度恢復(fù)循環(huán)5 d。接種后的培養(yǎng)基在主污染回路循環(huán)的同時(shí)，在5-L瓶中填充新鮮的生物膜培養(yǎng)基，用第二蠕動(dòng)泵以125 mL/h的速度泵送內(nèi)容物，為熒光假單胞菌繼續(xù)生長(zhǎng)添加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(圖2)。

在生物膜發(fā)育過(guò)程中，生物膜樣品(即污染回路不銹鋼管)在以下時(shí)間點(diǎn)取出:循環(huán)開(kāi)始前(即2天停滯孵化后)和循環(huán)5天期間每天取出。每個(gè)生物膜樣品由2管組成，一管用于熒光假單胞菌計(jì)數(shù)，另一管用于掃描電鏡檢查。

2.6. 使用臭氧輔助CIP去除食品加工設(shè)備中的熒光假單胞菌生物膜

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，用洗滌劑溶液清洗所有加工設(shè)備的元件并漂洗。除產(chǎn)品罐外，這些元件在121°C下高壓滅菌30分鐘。在實(shí)施CIP之前，為了在設(shè)備上形成生物膜，在罐和出口管道之間添加污染液，并允許流過(guò)填料、旁路、5.08厘米的小管段和彎頭，然后返回污染回路。初步試驗(yàn)表明，該加工槽易于清洗，因此，該加工槽出口管道是研究的主要對(duì)象。因此，受污染的部件為t形管(8)、旁通閥(9)、填料(10)、旁通管線(11)、4個(gè)表面粗糙的小管段(12)和4個(gè)表面光滑的90°彎頭(13)。接種后的生物膜培養(yǎng)基先在循環(huán)中循環(huán)30分鐘，停滯2天，然后恢復(fù)循環(huán)5天，如上所述。在形成堅(jiān)固的熒光假單胞菌生物膜后，CIP工藝按以下步驟依次實(shí)施:(1)預(yù)漂洗，(2)漂洗后的堿性清洗，(3)臭氧消毒。管段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件13)是用來(lái)評(píng)估CIP步驟去除熒光假單胞菌生物膜有效性的部分。每個(gè)CIP步驟后，去除一個(gè)節(jié)段和肘部，替換新鮮無(wú)菌部分，并擦拭其內(nèi)表面以評(píng)估生物膜去除情況。

2.6.1. 除去

一旦生物膜形成過(guò)程完成，被污染的處理設(shè)備連接到CIP系統(tǒng)，隨后去除污染系統(tǒng)。采用過(guò)濾35 μm的自來(lái)水，在22-25℃溫度下進(jìn)行預(yù)升。沖洗水由水箱經(jīng)CIP進(jìn)口泵以56.7 L/min的速度單次輸送，保證湍流流動(dòng);流體的流速為1.87 m/s。沖洗時(shí)間確定為1 min，以確保去除所有乳土。

2.6.2. 堿性的清潔

用水預(yù)漂洗后，將過(guò)濾35 μm的自來(lái)水與堿性洗滌劑(CIP 100;Steris, Mentor, OH)，達(dá)到0.2%的濃度。通過(guò)在線加熱器循環(huán)，將溶液加熱至50°C。溫度由溫度控制器(歐姆龍E5C2, Allied Electronics & Automation, Worthington, OH)管理。待溫度穩(wěn)定后，向加工設(shè)備內(nèi)充入堿性溶液，以56.7 L/min的速度循環(huán)2 min。清洗過(guò)程中控制溫度(50±2℃)和流速(1.87 m/s)。

2.6.3. Post-rinse

后沖洗消除了被清洗系統(tǒng)中的堿痕跡，并冷卻了系統(tǒng)，使其為臭氧消毒做好準(zhǔn)備。經(jīng)過(guò)35 μm過(guò)濾的自來(lái)水從用于水預(yù)沖洗的水箱中取出。將漂洗水引入系統(tǒng)，并測(cè)定了溶液在進(jìn)出口線的電導(dǎo)率。當(dāng)水電導(dǎo)率達(dá)到所需值(22-25℃下300-320 μsc)時(shí)，再繼續(xù)沖洗1分鐘，直至沖洗完畢并關(guān)閉水泵。水流穩(wěn)定在56.7 L/min。

2.6.4. 臭氧衛(wèi)生處理

在環(huán)境溫度(22-25°C)下使用臭氧水溶液作為消毒劑?？諝庾鳛槌粞醢l(fā)生器的入口氣體，因?yàn)樗幸粋€(gè)集成的氧氣濃縮系統(tǒng)。用電暈放電法將濃氧轉(zhuǎn)化為臭氧，并借助文丘里裝置與水混合。將臭氧水溶液儲(chǔ)存在臭氧-水箱中(圖1)，通過(guò)離心泵(古爾茲泵型號(hào):NPE 1ST1F1B4)在文丘里腔內(nèi)循環(huán)，直至達(dá)到所需濃度。過(guò)量的臭氧由熱催化臭氧破壞裝置(Del ozone)去除。在該研究中測(cè)試了5 ppm或10 ppm的含水臭氧。低濃度(5ppm)應(yīng)用5min, 10ppm的臭氧溶液測(cè)試10min。溶液中臭氧濃度由臭氧監(jiān)測(cè)儀(Q450;ATI，學(xué)院維爾，賓夕法尼亞州)在進(jìn)口和出口線。此外，通過(guò)分光光度計(jì)(Spectronic 1201, Milton Roy Co.， Houston, TX)在258 nm (A258)處測(cè)量紫外吸收，采用紫外光譜法確定了水溶液中臭氧的濃度。

2.6.5. 臭氧輔助CIP系統(tǒng)的抗菌膜效果

改進(jìn)的CIP系統(tǒng)對(duì)未附著的(浮游)和附著的(生物膜)熒光假單胞菌細(xì)胞群的有效性進(jìn)行了評(píng)估。浮游細(xì)胞的樣本從CIP回路回路上的隔膜取樣口采集(圖1)。這些樣本在清洗過(guò)程開(kāi)始前，在預(yù)漂洗、后漂洗堿性清洗和臭氧消毒后，使用10cc注射器(Becton, Dickinson & Co.)采集。在0.1%蛋白胨水中進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)⑹褂霉嘧㈠兗夹g(shù)將1ml等分液與熔融TSA (Becton Dickinson & Co.)混合(Yousef et al.， 2022)。30℃孵育48 h，計(jì)數(shù)菌落。第二種類(lèi)型的采樣是為了推斷清潔過(guò)程對(duì)生物膜細(xì)胞的有效性。生物膜樣品取自粗糙和光滑表面;這些分別是不銹鋼節(jié)段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件13)。為了評(píng)估CIP對(duì)熒光假單胞菌生物膜種群的影響，在整個(gè)清洗過(guò)程開(kāi)始前，在預(yù)漂洗、后漂洗堿性清洗和臭氧消毒后，分別去除一段和一個(gè)肘部。將切除的切片替換為無(wú)菌切片，并恢復(fù)清洗過(guò)程。

2.7. 生物膜的枚舉

為了確定污染裝置形成的生物膜，在5天的生物膜介質(zhì)循環(huán)中，每天從污染回路(圖2，組件7)中取出兩根小不銹鋼管，以監(jiān)測(cè)強(qiáng)健生物膜的發(fā)展。將每個(gè)不銹鋼管無(wú)菌放入含有25 mL 0.1%蛋白胨水的50 mL螺旋蓋小瓶中。手動(dòng)搖瓶，然后用另外10ml 0.1%蛋白胨水沖洗試管，以去除未附著的細(xì)胞。用兩根無(wú)菌棉簽拭除管內(nèi)表面的生物膜細(xì)胞，將棉簽尖端斷開(kāi)，放入含有9ml 0.1%蛋白胨水的玻璃管中。管，包括拭子，在旋渦混合器(Fisher Scientific Industries, Inc.， Bohemia, NY)中混合約30秒。將得到的懸浮液用0.1%蛋白胨水稀釋?zhuān)玫瑰兎▽⑵溴冊(cè)赥SA上，并在30°C下孵育2天(Yousef et al.， 2022)。每管平均CFU換算為CFU/ cm2。

為了在臭氧輔助CIP過(guò)程中對(duì)熒光p.h ncens生物膜進(jìn)行計(jì)數(shù)，用三根無(wú)菌棉簽(Fisher Scientific)擦拭不銹鋼節(jié)段和肘部的內(nèi)表面，將生物膜細(xì)胞從棉簽的尖端分離到含有25 mL 0.1%蛋白胨水的管中。包括拭子在內(nèi)的試管在旋渦混合器中混合約30秒。將得到的懸浮液用0.1%蛋白胨水稀釋后，用倒鍍法鍍?cè)赥SA上，在30℃下孵育2天。每節(jié)平均CFU數(shù)換算為CFU/100 cm2。

2.8. 掃描電子顯微鏡對(duì)生物膜的檢查

為了用掃描電鏡檢查小不銹鋼管內(nèi)的生物膜，需要一些準(zhǔn)備;這些準(zhǔn)備工作按照之前的描述進(jìn)行(Speers等人，1984;Latorre et al.， 2010)，并做了一些修改。從污染系統(tǒng)中取出的試管，用10ml 0.1%蛋白胨水沖洗，然后放入玻璃小瓶中。用2.5%戊二醛固定于0.1 M磷酸緩沖液中，pH為7.4的葡萄糖溶液中。試管在0.1 M磷酸鹽緩沖液中沖洗3次，每次15分鐘，然后將每個(gè)試管小心地縱向切成兩半。半管片在0.1 M磷酸鹽緩沖液中沖洗三次，每次沖洗15分鐘。將洗滌后的含生物膜的半管分別在增加濃度的乙醇(25、50、70、85和95%)中脫水10分鐘，然后在100%乙醇中脫水3次，每次30分鐘。將干燥的樣品安裝在鋁樁上，并在濺射涂層機(jī)(Cressington, Redding, CA)中用金涂層2分鐘。對(duì)樣品進(jìn)行掃描電鏡成像(Nova 400 NanoSEM, FEI, Hillsboro, OR)。

2.9. 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行，并獨(dú)立重復(fù)兩次。數(shù)據(jù)用兩個(gè)獨(dú)立重復(fù)的平均值±SD表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Prism 9.0.0;GraphPad軟件公司，圣地亞哥，加州)。采用方差分析(ANOVA)，采用Tukey兩兩比較，確定治療組之間或治療對(duì)比較的顯著性差異。p≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)論

在中試規(guī)模的食品加工設(shè)備上開(kāi)發(fā)堅(jiān)固的生物膜具有挑戰(zhàn)性;然而，克服這一限制使我們能夠驗(yàn)證臭氧輔助CIP是消除熒光假單胞菌生物膜的有效方法。本研究提供的證據(jù)表明，標(biāo)準(zhǔn)的就地清洗制度使熒光假單胞菌浮游細(xì)胞低于計(jì)數(shù)法的檢出限;然而，完全消除生物膜細(xì)胞是不可能的。在清潔過(guò)程中加入臭氧作為消毒劑，可以完全去除加工設(shè)備粗糙或光滑表面上的生物膜細(xì)胞。目前的研究表明，臭氧輔助CIP可以成為食品加工商凈化加工設(shè)備的有效方法，特別是在乳制品行業(yè)。