臭氧對(duì)營(yíng)養(yǎng)菌和孢子菌的滅活作用研究

不同類(lèi)型微生物的氣態(tài)臭氧滅活是成功地實(shí)現(xiàn)的，眾所周知，只要?dú)庀啾粡?qiáng)烈加濕。然而，這一過(guò)程中涉及的失活機(jī)制和物種尚未明確確定。為了深入了解，我們考慮將細(xì)菌孢子暴露在干燥而不是潮濕的臭氧中，這是一種不太復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境。與大多數(shù)已發(fā)表的文獻(xiàn)相反，研究表明，在嚴(yán)格的干燥臭氧條件下，細(xì)菌孢子可以滅活，但滅活程度在很大程度上取決于孢子類(lèi)型和底物材料。在這種情況下，由于沒(méi)有檢測(cè)到孢子的外部侵蝕，因此確定O3分子通過(guò)其擴(kuò)散到孢子內(nèi)并在孢子內(nèi)氧化作用來(lái)負(fù)責(zé)失活過(guò)程。

使用加濕臭氧，觀察到較高的失活效率，這很可能部分與孢子的膨脹ling有關(guān)，這有助于氧化物質(zhì)在其內(nèi)部擴(kuò)散并一直擴(kuò)散到核心;除O3外，這些氧化劑源于O3與H2O的相互作用，很終導(dǎo)致孢子結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，而與干臭氧暴露相比，孢子完整性得以保持。

以往工作回顧

從一開(kāi)始以及此后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，在環(huán)境空氣中使用臭氧作為氣態(tài)殺菌劑的濃度水平被限制在接近1ppm的水平(事實(shí)上，就人體毒性而言，0.1 ppm被確定為占用(每周40小時(shí))很大安全值)。

Elford和Van de Eude(1942)在已知溫度和相對(duì)濕度(RH)值的房間中對(duì)氣溶膠化細(xì)菌懸浮液進(jìn)行了研究，他們確定在60-80% RH的房間中，臭氧濃度超過(guò)1ppm是相對(duì)于干燥環(huán)境的更好條件。

Kowalski等人(1998)研究了空氣中高濃度臭氧對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的影響。

將微生物暴露于空氣中濃度為300至1500 ppm、相對(duì)濕度為18-20%的臭氧中10至480秒:在1500 ppm和8分鐘內(nèi)，兩種微生物的死亡率均超過(guò)99.99% (>4 log)。

依靠干氣體臭氧，但濃度要高得多，Held研究了醫(yī)院廢物的凈化(Held, 2002;Coronel等人，2002年)，由革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性的營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌、真菌、分枝桿菌和孢子細(xì)菌(如萎縮芽孢桿菌、嗜脂嗜熱地桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌)組成。測(cè)試了從干空氣電暈放電中獲得的臭氧濃度為10,000-12,000 ppm。

該系統(tǒng)允許超過(guò)107個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌/mL的失活(金黃色葡萄球菌，萎縮桿菌，大腸桿菌…)

暴露1小時(shí)內(nèi)，處理2小時(shí)后孢子數(shù)超過(guò)107個(gè)/mL。

Ishizaki等人(1986)研究了臭氧濃度在250至1500 ppm(0.5至3 mg/L)范圍內(nèi)的氣態(tài)臭氧對(duì)不同芽孢桿菌孢子的殺孢活性，并著重研究了相對(duì)濕度水平的影響。

在50%或更低的相對(duì)濕度下，暴露6小時(shí)后，存活的數(shù)量沒(méi)有明顯減少。

然而，在較高的RH值下，在不到2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)達(dá)到了5對(duì)數(shù)的降低，這一點(diǎn)后來(lái)被Currier等人(2001)證實(shí)。

Aydogan和Gurol(2006)的結(jié)果還表明，在70-95%相對(duì)濕度的條件下，將O3濃度從1 mg/L增加到3 mg/L，可以提高孢子的失活率，但超過(guò)3 mg/L (1500 ppm)時(shí)，只觀察到微弱的額外增加。

從前面的作品中可以看出三點(diǎn):

(i)臭氧濃度越高，相對(duì)濕度越高(0.50%)，滅活過(guò)程越有效。

事實(shí)上，在某些情況下，濕度是絕對(duì)需要的，以達(dá)到無(wú)菌，如TSO3的情況

TM滅菌系統(tǒng)，由加拿大衛(wèi)生部和FDA(美國(guó)食品藥品管理局)批準(zhǔn);

(ii)加濕的氣態(tài)臭氧相對(duì)于干的氣態(tài)臭氧作為殺生劑的附加值肯定是在干臭氧條件下幾乎沒(méi)有工作的部分原因(Ishizaki et al.， 1986);

(iii)然而，根據(jù)文獻(xiàn)尚未嚴(yán)格確定臭氧過(guò)程中涉及的失活機(jī)制和物種。

臭氧暴露下可能的失活機(jī)制綜述

強(qiáng)氧化劑通常能夠化學(xué)攻擊微生物的成分，即蛋白質(zhì)、不飽和脂質(zhì)、革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖層、細(xì)胞內(nèi)酶(如呼吸酶)和核酸(遺傳物質(zhì))，以及孢子外殼和病毒衣殼中的蛋白質(zhì)和肽聚糖(Tseng和Li, 2008)。

營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌

臭氧使?fàn)I養(yǎng)細(xì)菌失活是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，因?yàn)槌粞鯐?huì)破壞營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的大量成分;然而，O3被認(rèn)為主要引起細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化。這些結(jié)構(gòu)的逐漸降解涉及到滲透性和細(xì)胞完整性的改變，并且通常伴隨著細(xì)胞裂解(Broadwater et al.， 1973;Kim and Yousef, 2000;Khadre and Yousef, 2001;Thanomsub et al.， 2002)。

沿著這條線，Kim和Youssef(2000)觀察到革蘭氏陰性菌(大腸桿菌…)的損害更為明顯?？赡苁且?yàn)樗鼈兊闹嗵菍颖雀锾m氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌…)(Komanapali and Lau, 1998;Komanapali and Lau, 1996)。Hunt和Marinas(1999)基于透射電子顯微鏡(TEM)顯微照片對(duì)細(xì)菌失活提出了不同的解釋:他們觀察到臭氧處理后大腸桿菌的類(lèi)核收縮。這些作者得出結(jié)論，O3能夠穿透細(xì)胞，并與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或許多酶發(fā)生反應(yīng)，這些酶參與控制DNA con的形成，從而導(dǎo)致其錯(cuò)誤折疊。

細(xì)菌孢子

研究細(xì)菌孢子的主要興趣在于它們是耐藥的微生物，正因?yàn)槿绱?，官方要求?yàn)證滅菌過(guò)程。細(xì)菌孢子可以經(jīng)受?chē)?yán)酷的處理，包括熱、輻照、化學(xué)藥品和干燥。芽孢桿菌種類(lèi)的細(xì)菌孢子已被證明對(duì)臭氧特別敏感 (Kowalski et al.， 1998)，因此被用于本研究。人們先驗(yàn)地認(rèn)為，細(xì)菌材料孢子受臭氧的影響比營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌小，因?yàn)樗鼈兙哂卸鄬颖Ｗo(hù)和抗逆性。文獻(xiàn)中已經(jīng)提出了誘導(dǎo)孢子致死的各種O3靶點(diǎn)，下面我們將詳細(xì)介紹。

酶

一些作者認(rèn)為酶損傷是O3殺死細(xì)胞的重要失活機(jī)制(Hinze et al.， 1987;Takamoto et al.， 1992)。Young和Setlow(2004)表明，與野生型孢子相比，缺乏某種酶(第二皮層裂解酶(SleB))的萎縮芽孢桿菌突變孢子被O3滅活的速度更快(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。此外，Takamoto等人(1992)觀察到，臭氧在不同程度上降低了大腸桿菌中酶的活性，這取決于所考慮的酶的具體性質(zhì)。

DNA。它也可能是一個(gè)靶標(biāo)，因?yàn)镺3與核堿基反應(yīng)迅速，尤其是胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶(Ishizaki et al .， 1986;Swadeshi et al.， 1986)。相反，像Young和Setlow(2004)這樣的作者聲稱(chēng)水中的臭氧不會(huì)通過(guò)DNA損傷殺死孢子。在這里，水中的O3在100% RH的環(huán)境中被同化為臭氧。孢子的外套。孢子被毛是指，從孢子很外層開(kāi)始，表層，然后是外被毛和內(nèi)被毛。再往里看，有皮層，內(nèi)膜和包含DNA的核心。孢子外殼約占孢子體積的50%，包含約80%的孢子蛋白質(zhì)，因此構(gòu)成代謝功能損傷的屏障(例如酶)。

孢子對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性的主要因素似乎是孢子的外殼(Komanapali和Lau, 1996;Young and Setlow, 2004)。Kim等人(2003)的TEM顯微照片也支持了這一觀點(diǎn)，在水氧化處理的情況下，TEM顯微照片顯示了對(duì)表層以及外層和內(nèi)層的損害。這種損傷為O3在皮層上的作用開(kāi)辟了道路，很終通過(guò)細(xì)胞內(nèi)損傷導(dǎo)致孢子失活(Kim et al.， 2003;Young and Setlow, 2004)。

此外，F(xiàn)oegeding(1985)發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌的外殼蛋白被去除后，在水溶液中比完整的孢子更快地失活:他們得出結(jié)論，孢子的外殼是對(duì)抗O3分子的主要保護(hù)屏障。更廣泛地說(shuō)，化學(xué)脫去的孢子和外殼有缺陷的孢子(結(jié)果來(lái)自主要外殼形成蛋白cotE的突變)被水溶液O3殺死的速度要比外殼完整的孢子快得多(Young和Setlow, 2004)。這使得Young和Setlow(2004)得出結(jié)論，孢子外殼(特別是在萎縮芽孢桿菌孢子中)在孢子對(duì)O3的抗性中是必不可少的。膜也會(huì)被氧化劑破壞，包括O3 (Cortezzo et al.， 2004)。很近的研究結(jié)果表明，孢子內(nèi)膜可能是O3致死性損傷的部位，因?yàn)槭軗p的內(nèi)膜:

(i)阻止孢子在正常模式高溫?zé)崽幚砘蚱涿劝l(fā)形式面臨滲透脅迫時(shí)保持完整性;

(ii)因?yàn)樗兊酶哂袧B透性。Cortezzo等人(2004)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氧化劑對(duì)孢子內(nèi)膜的破壞也與觀察到的甲胺更快地滲透到處理過(guò)的孢子核心一致:內(nèi)膜可能是甲胺進(jìn)入孢子核心的關(guān)鍵滲透性屏障。這一滲透性屏障的破裂可能導(dǎo)致孢子核心內(nèi)容物的釋放(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。

為了深入了解臭氧暴露后微生物的失活機(jī)制，我們首先使用干燥的氣態(tài)臭氧，這是一個(gè)比潮濕的氣態(tài)臭氧更不復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境:

在氣態(tài)臭氧中加入水蒸氣會(huì)帶來(lái)額外的氧化劑，使確定它們的相對(duì)貢獻(xiàn)和確定失活機(jī)制變得更加困難。本文通過(guò)存活曲線研究了細(xì)菌孢子在嚴(yán)格干燥臭氧條件下的inac活化動(dòng)力學(xué)，并利用掃描電鏡 (SEM)檢查了相應(yīng)的損傷。還介紹了暴露于加濕臭氧的孢子的這種特征數(shù)據(jù)。利用文獻(xiàn)資料，對(duì)這兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果(干臭氧和濕臭氧情況)進(jìn)行密切的“不同”分析，使我們能夠提出一幅新的更詳細(xì)的圖片，說(shuō)明細(xì)菌孢子在臭氧作用下的失活機(jī)制。

材料與方法

由于臭氧具有很強(qiáng)的氧化能力，它能或多或少地破壞各種材料。為了盡量減少這種可能的影響，這可能會(huì)干擾我們的實(shí)驗(yàn)，滅菌室由316不銹鋼制成(要求承受加濕臭氧)，用于光譜觀察的窗戶(hù)由熔融二氧化硅制成。待調(diào)查的微生物沉積在由聚苯乙烯(干臭氧暴露)或耐熱玻璃(濕臭氧暴露)制成的培養(yǎng)皿上。

臭氧化系統(tǒng)

圖1顯示了用于產(chǎn)生臭氧并在臭氧進(jìn)入和離開(kāi)腔室時(shí)測(cè)定其濃度的系統(tǒng)的各種元件。

該腔室由316不銹鋼制成，是一個(gè)400毫米長(zhǎng)，100毫米高，220毫米寬的平行六面體(6升體積)。

臭氧濃度可以用基于紫外線吸收的分析儀來(lái)監(jiān)測(cè)。

生成的廢水也可以通過(guò)FTIR光譜進(jìn)行分析:來(lái)自Thermo Nicolet的Avatar 370光譜儀使用DTGS (7800-375 cm-1)探測(cè)器，掃描次數(shù)和分辨率分別設(shè)置為80和1 cm-1。

臭氧發(fā)生器在氣相中提供分子氧和原子氧的混合物;

它在電流范圍內(nèi)工作，在電流范圍內(nèi)增加臭氧濃度。

臭氧流是干燥的，因?yàn)榘l(fā)生器是由(高純度)O2干氣瓶提供的。

本文所用的“干臭氧”一詞是指相對(duì)濕度(RH)小于約2%(用濕度計(jì)測(cè)定)的氣態(tài)臭氧。

總氣體流量設(shè)定為5.64標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘(slm)，在干燥條件下實(shí)現(xiàn)臭氧濃度為4,000 ppm。

在工藝線的末端安裝了一個(gè)臭氧破壞者，用于減少臭氧并將其作為O2釋放，以符合安全(毒性)法規(guī)。

出于安全考慮，該腔室也位于通風(fēng)柜內(nèi)，并連接了真空干泵，以確保在過(guò)程結(jié)束時(shí)腔室流出物被完全排出。

在使用加濕臭氧的過(guò)程中可以加入水蒸氣。

水通過(guò)蠕動(dòng)泵送到“烤箱”(加熱器)，產(chǎn)生的蒸汽被進(jìn)入的O2氣流驅(qū)動(dòng)到O3管線。

在給定的加熱器溫度和給定的O2流量下，注入的水蒸氣量取決于蠕動(dòng)泵設(shè)定的H2O流量。

在單獨(dú)存在O2的情況下，用濕度計(jì)(Kahn, Wethersfield, CT, USA)測(cè)定腔內(nèi)相應(yīng)的RH水平(RH可精確測(cè)量至少95%(0.3%))。

在加濕條件下，總氣體流量設(shè)置為2.6 slm，以實(shí)現(xiàn)約4 000 ppm的臭氧濃度。

腔內(nèi)氣體溫度保持接近環(huán)境溫度(≈22℃)。

總結(jié)與結(jié)語(yǔ)

了解暴露于加濕氣體臭氧導(dǎo)致的微生物失活機(jī)制是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的任務(wù)。我們的方法是，在嚴(yán)格的干燥氣體臭氧暴露(RH, 2%)下，檢查三種生物指示孢子和一種細(xì)菌的失活動(dòng)力學(xué)和形態(tài)損傷，然后考慮濕化氣體臭氧暴露的情況:很后，將這兩項(xiàng)研究的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，有助于揭示各種失活機(jī)制。

在干燥的氣態(tài)臭氧暴露下，我們已經(jīng)證明O3分子可以有效地滅活某些類(lèi)型的孢子(G. stearothermophilus)，而其他類(lèi)型的孢子(B. atrophaeus)則更少，滅活率的差異可能在于其成分的性質(zhì)或排列，本質(zhì)上是其外殼(和內(nèi)膜)的化學(xué)成分。孢子的形態(tài)不受干臭氧處理的影響，這意味著擴(kuò)散/氧化，而不是侵蝕，與O3分子的作用有關(guān)，這些分子在孢子內(nèi)移動(dòng)。

此外，我們還表明，沉積在不同聚合物基質(zhì)上的孢子的臭氧滅活效果取決于聚合物的性質(zhì)。

在加濕的氣態(tài)臭氧暴露下，我們認(rèn)為一個(gè)重要的初始機(jī)制(在殺生物作用之前)是孢子的水膨脹，這打開(kāi)了“通道”，促進(jìn)了殺生物劑的內(nèi)部擴(kuò)散。

這些是O3分子及其與H2O相互作用的副產(chǎn)物，產(chǎn)生高度氧化的物質(zhì)，如HO.2, OH。過(guò)氧化氫。這些氧化過(guò)程的很終結(jié)果是在一定程度上抵抗干臭氧作用的孢子(b.s atrophaeus)失活，在足夠長(zhǎng)的暴露時(shí)間后，這里使用的所有三種生物指示劑都被嚴(yán)重破壞，甚至粉碎。O3分子和氧化自由基對(duì)濕化臭氧失活過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)可以在未來(lái)的工作中確定。下一步可能是呼吁分子生物學(xué)來(lái)評(píng)估孢子核酸所遭受的損害的種類(lèi)和程度。

正在進(jìn)行涉及臭氧和表面凈化的進(jìn)一步工作。它涉及的事實(shí)是，通過(guò)將某些聚合物置于干燥的臭氧流(通常為4000 ppm 1小時(shí))中，可以賦予其生物殺滅性能。然后，當(dāng)在這些處理過(guò)的表面上沉積細(xì)菌孢子時(shí)，同一天或2-3天后，并讓它們干燥24小時(shí)，觀察到初始種群減少3到5對(duì)數(shù)(Mahfoudh等人，2010;Mahfoudh et al.， 2010)。