低濃度臭氧控制紅蘋果李斯特菌的有效性研究

        本研究旨在探討低劑量連續(xù)臭氧氣體對紅冠蘋果長期商業(yè)冷藏過程中無害李斯特菌和品質屬性及病害的控制效果。Red Delicious 蘋果以 ～6.2 log 10 CFU/蘋果接種三株無害乳桿菌混合物，用或不用 1-甲基環(huán)丙烯處理，然后在商業(yè)環(huán)境中用或不用連續(xù)氣態(tài)臭氧進行受控氣氛 (CA) 儲存設施 36 周。將經受上述儲存條件的未接種紅美味蘋果用于酵母/霉菌計數(shù)和質量屬性評估。36 周的冷凍空氣 (RA) 或 CA 儲存導致約 2.2 log 10 CFU/蘋果減少無害乳桿菌。與單獨的 RA 和 CA 存儲相比，臭氧氣體的應用導致無害乳桿菌的額外 > 3 log 10 CFU/蘋果減少。在 36 周的 CA 儲存過程中，連續(xù)施用低劑量的氣態(tài)臭氧顯著延緩了酵母/霉菌的生長，延緩了蘋果的硬度損失，并且對臭氧燃燒、皮孔腐爛、赤褐色、CO 2損傷、表面燙傷、與單獨 CA 存儲相比，Red Delicious 蘋果的軟燙?？傊?，連續(xù)應用低劑量氣態(tài)臭氧有可能控制紅美味蘋果上的李斯特菌，而不會對蘋果的品質屬性產生負面影響。

介紹

        單核細胞增生李斯特菌可在易感人群中引起致命的李斯特菌病，并且死亡率很高（CDC，2017）。單核細胞增生李斯特菌廣泛存在于農業(yè)環(huán)境中。美國食品和藥物管理局對蘋果和其他即食食品實施零容忍（Shank 等人，1996 年；FDA，2008 年）。蘋果在開放環(huán)境中生長，因此在生產或隨后的采后包裝過程中可能受到單核細胞增生李斯特菌的感染（ Angelo 等人，2017 年）。單核細胞增生李斯特菌與兩次多州焦糖蘋果暴發(fā)有關（Angelo 等人，2017 年；Marus 等人，2019 年）) 以及多個新鮮蘋果品種 ( FDA, 2017 , 2019 ) 和鮮切蘋果 ( FDA, 2016 , 2020b ) 的多次召回。這些暴發(fā)和召回凸顯了蘋果李斯特菌污染的風險以及控制蘋果李斯特菌的重要性。收獲后，蘋果通常在受控氣氛 (CA) 冷藏庫中冷藏長達 12 個月。在這種長期儲存過程中進行抗菌干預可以為控制新鮮蘋果上的李斯特菌提供潛在的干預策略（ Sheng 和 Zhu，2021 年）。

        臭氧是一種強氧化劑和強效抗菌劑，不會在處理過的產品上留下任何殘留物（Guzel-Seydim 等人，2004 年）。臭氧氣體被食品和藥物管理局批準為公認安全劑（FDA，2020a），并被批準用于有機生產和處理（USDA-NOP，2021）。已經研究了以固定速率在短時間內控制主要食源性病原體的氣態(tài)臭氧，包括大腸桿菌O157:H7（Han 等人，2002 年）、沙門氏菌（Das 等人，2006 年）和單核細胞增生李斯特菌（Alwi 和 Ali，2014 年；Concha-Meyer 等人，2014 年) 新鮮農產品。例如，10 mg/L 的臭氧氣體可在1 小時內使番茄上接種的腸炎沙門氏菌減少約 7 log 10 CFU/番茄（Das等人，2006 年）。在 4°C 下儲存 10 天后，新鮮藍莓上的 4 mg/L 氣態(tài)臭氧可將單核細胞增生李斯特菌減少 3 log 10 CFU/ml（ Concha-Meyer 等人，2014 年）。20 分鐘的氣態(tài)臭氧 (23 mg/L) 暴露導致帝國蘋果上單核細胞增生李斯特菌的 2.1–3.1 log 10 CFU/蘋果減少（Murray 等人，2018 年）。還研究了臭氧氣體以控制不同蘋果品種在儲存期間的常駐微生物群（Yaseen 等，2015）。在 1°C 儲存條件下，暴露 0.5 mg/L 的臭氧氣體 60 天會導致新鮮蘋果上的擴展青霉減少 2.7-4.0 log ，具體取決于品種（Yaseen 等人，2015 年）。

       此外，在儲存期間使用臭氧氣體有利于保持水果品質。例如，據報道，1-3 毫克/升的臭氧暴露可保持蘋果的硬度（Antos 等人，2018 年）并減少蘋果的重量損失（Juhnevica-Radenkova 等人，2019 年）。我們之前表明，在 CA 儲存中連續(xù)應用 30 周 87 μg/L 的氣態(tài)臭氧可將富士蘋果上李斯特菌減少 5.0 log 10 CFU/蘋果，而不會對蘋果果實質量產生負面影響。盛等人，2018）。然而，這種影響不能直接轉移到其他蘋果品種，因為每個蘋果品種都有其獨特的表皮蠟和常駐微生物群組成，這些成分會影響李斯特菌的持久性和對抗菌干預的反應（Chai 等人，2020 年；Ku 等人，2020 年；Abdelfattah 等人）等，在新聞中）。

        Red Delicious 蘋果是美國很暢銷的蘋果品種之一（USAA，2019 年），很近因潛在的單核細胞增生李斯特菌污染而被召回（FDA，2019 年）。與其他商業(yè)化種植的蘋果品種相比，Red Delicious 蘋果特別容易出現(xiàn)水核，在長期 CA 儲存期間發(fā)生內部疾?。ɡ鐑炔亢肿儯┑娘L險增加（Mattheis，2008 年），進一步導致蘋果產業(yè)遭受損失。本研究的目的是研究不同商業(yè)儲存方式與不同劑量的連續(xù)氣態(tài)臭氧在控制無害李斯特菌方面的效果，在有或沒有 1-甲基環(huán)丙烯 (1-MCP) 預處理的 Red Delicious 蘋果上與L. monocytogenes ( Buchrieser et al., 2003 ) 在系統(tǒng)發(fā)育上相關。進一步評價了紅冠蘋果在不同貯藏條件下品質屬性的維持情況。

材料和方法

無害李斯特菌培養(yǎng)準備

        兩種L. innocua 食品分離物，NRRL 33314 和 NRRL 33554，以及一種加工廠分離物L. innocua，NRRL 33197，來自 USDA-ARS 培養(yǎng)物保藏中心 [National Center for Agriculture Utilization Research (NRRL), Peoria, IL, United州] 并儲存在添加 0.6% 酵母提取物 (TSBYE；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, United States) (TSBYE) 和 20 -80°C 下的 % (v/v) 甘油。每個冷凍培養(yǎng)物在 TSBYE 中在 37°C 下連續(xù)轉移兩次 24 小時。通過組合等量的單個L. innocua菌株來制備三菌株雞尾酒接種物。個體L. innocua通過在 TSAYE（含 1.5% 瓊脂的 TSBYE）板上連續(xù)稀釋和鋪板來計數(shù)菌株或三菌株混合物。

蘋果接種

        新鮮未上蠟的紅美味蘋果，在商業(yè)成熟時手動收獲，康奈爾淀粉指數(shù)顯示范圍為 2.8-3.5（Blanpied 和 Silsby，1992 年），儲存在商業(yè)儲藏室（亞基馬，華盛頓州，美國），溫度為 ～ 1°C 并在研究前送到實驗室。本研究選擇了沒有割傷、瘀傷或疤痕的蘋果（~200 克）。對于L. innocua接種，將蘋果浸入在無菌磷酸鹽緩沖鹽水（1 × PBS，pH 7.4）中稀釋的三株L. innocua接種物中，以獲得約 6.2 log 10的接種水平CFU/蘋果。接種后的蘋果在室溫（~22°C）下放置 24 小時，然后進行相應的儲存。分別在 0 和 24 小時隨機抽取 40 個接種蘋果，以確認初始細菌水平和接種的均勻性。

蘋果的貯藏處理

        接種后 24 小時的蘋果被隨機裝入塑料箱中；每箱 40 個蘋果。將盒裝接種過的蘋果隨機分成6組，其中一半在貯藏前用1.0 mg/L 1-MCP氣態(tài)空氣處理24 h。然后將蘋果置于冷凍空氣 (RA; 0.2 ± 0.1°C) 和 CA (0.2 ± 0.1°C, 3.1 ± 0.0% O 2 , 0.4 ± 0.0% CO 2 ) 中，有或沒有 60.2 ± 5.7 或78.7 ± 13.2 μg/L 在半商業(yè) RA/CA 房間（3,200 ft 2）在商業(yè)設施（Stemilt Growers LLC，Wenatchee，WA，United States）中的相對濕度約為 90%。臭氧氣體由商用臭氧發(fā)生器產生，并通過比例-積分-導數(shù)算法自動轉移到儲存室，以在儲存期間將臭氧劑量保持在目標水平。臭氧濃度在儲存的第一周開始，在第四周開始時達到目標濃度。同時，分離的未接種蘋果組被包括在上述儲存條件中，用于居民微生物區(qū)系計數(shù)和蘋果品質評價。

        接種后的蘋果在儲存 3、6、12、18、24、30 和 36 周后取樣，用于L. innocua計數(shù)。在儲存 6、12、24 和 36 周后對未接種的蘋果進行取樣，以測定總平板計數(shù) (TPC) 和酵母/霉菌計數(shù)。蘋果質量屬性在收獲時和儲存 6 個月和 9 個月時進行評估。每個貯藏條件下每個時間點取樣 40 個蘋果用于微生物計數(shù)、質量屬性和內部紊亂評價，而每個貯藏條件下每個時間點采樣 100 個蘋果用于外部紊亂評價，其中每個蘋果被視為一個實驗單元。

無害李斯特菌枚舉

將每個蘋果轉移到裝有 10 ml 無菌 1 × PBS 的胃袋（Fisher Scientific）中，并用手揉搓 80 秒。摩擦溶液用無菌 1 × PBS 連續(xù)稀釋 10 倍，鋪在 TSAYE 板上，然后覆蓋改性牛津瓊脂 (MOX) (BD) 以區(qū)分李斯特菌和背景細菌（Shen 等人，2019 年），并在37°C 48 小時。L. innocua在 MOX 瓊脂平板上產生典型的黑色菌落，周圍有黑色暈圈。對于低于檢測限（10 CFU/蘋果）的樣品，將 1.0 ml 摩擦溶液在緩沖的李斯特菌富集緩沖液 (BLEB) (BD) 中在 30°C 下富集 48 小時；李斯特菌的存在/不存在已經報道。將富集培養(yǎng)物分別劃線到 MOX 和 CHROMagar TM 李斯特菌（CHROMagar，Paris，F(xiàn)rance）平板上，以定性檢測李斯特菌的存在（Sheng 等人，2017 年）。在每個時間點，每個存儲方案的樣本大小為每次復制 10 個蘋果，每個存儲方案有四個獨立的復制。

居民微生物群計數(shù)

未接種蘋果的處理方式與接種蘋果相同。將適當稀釋度的摩擦溶液分別鋪在重復的 TSAYE 板和馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA; BD) 板上，用于 TPC 和酵母/霉菌計數(shù)。TSAYE 板在 37°C 下孵育 24 小時，而 PDA 板在室溫 (22°C) 下孵育 5 天。在每個時間點，每個存儲方案的樣本大小為每次復制 10 個蘋果，每個存儲方案有四個獨立的復制。

水果品質分析

根據已發(fā)表的方法，在收獲時以及冷藏后 6 個月和 9 個月時對未接種蘋果的果實質量屬性（包括硬度、總可溶性固形物 (TSS) 和可滴定酸度 (TA) 進行了評估（Sheng 等人，2018 年）。簡而言之，使用水果質地分析儀（FTA GS-15-643，Güss Manufacturing，Ltd.，Strand，南非）在去皮區(qū)域（~3 cm 2) 在每個蘋果的陽光照射和陰影面。TSS 含量使用 Atago PR-32 數(shù)字糖度折光儀（Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan）測量。果汁的 TA 表示為蘋果酸含量的百分比（每 100 克蘋果鮮重的蘋果酸克數(shù)），并使用電位滴定儀（Titrando 888 和 875 Robotic USB Sample Processor XL, Metrohm, Riverview, FL, United狀態(tài)）。蘋果質量分析使用了每次重復 10 個蘋果的樣本量，每個存儲方案有四個獨立的重復。

水果障礙分析

在收獲時和冷藏 6 個月和 9 個月后檢查水果是否有外部疾病。外部疾病包括臭氧燒傷（蘋果暴露側的表面凹坑）、表面燙傷（皮膚上的棕色斑塊和變色）、皮孔腐爛（皮孔周圍的深棕色凹坑）、腐爛（可見的菌絲體或孢子團）、赤褐色（在皮膚）和 CO 2損傷（皮膚上的雪花樣斑塊）按照先前描述的標準標準進行目視檢查（Sheng 等人，2018 年）。軟燙傷，特征是蘋果表面有光滑或不規(guī)則形狀的棕色損傷（DeEll，2013)，也進行了評估。蘋果被切片 3 次，用于評估內部疾病，包括水核和內部褐變。Watercore 的特點是富含山梨糖醇的液體在與脈管系統(tǒng)相鄰的肉的細胞間隙中積聚（Marlow 和 Loescher，1984 年）。內部褐變的特征是通常起源于核心區(qū)域附近的果肉變褐色（Argenta 等，2001）。結果報告為每個貯藏期內單獨處理中的蘋果與各自的無序/總蘋果 (%)。內部紊亂評估使用每個重復 10 個蘋果的樣本大小，每個儲存方案有四個獨立重復。對于外部紊亂評估，每個存儲方案使用 100 個蘋果的樣本大小。在室溫 (22°C) 下 1 天和 7 天后對蘋果進行評估。

統(tǒng)計分析

使用 IBM SPSS 19.0 (Chicago, IL, United States) 分析數(shù)據。通過單向方差分析 (ANOVA) 識別平均差異，然后進行 Tukey 多重比較測試。p < 0.05 的值被認為具有統(tǒng)計學意義。

圖所示。紅鮮蘋果商業(yè)冷藏36周內無毒蜱的存活研究。a - cMean在沒有公共字母的各采樣點上差異顯著(p < 0.05)。平均值±SEM, n = 32-40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲存，氣體O3持續(xù)施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連續(xù)施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲存時連續(xù)施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

圖在商業(yè)冷藏的36周內，紅美味蘋果上的駐留細菌。a,b不帶公共字母的各采樣點均值差異顯著(p < 0.05)。均值±SEM, n = 40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲存，氣體O3持續(xù)施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲存時連續(xù)施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲存時連續(xù)施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

結論

經過 9 個月的商業(yè) RA 或 CA 儲存，Red Delicious 蘋果上的無害乳桿菌計數(shù)減少了 ~2 log CFU/蘋果。在60.2–78.7 μg/L 的連續(xù)低劑量臭氧氣體處理下，無害乳桿菌的減少量增加了 1,000 倍；> 5.0 log 10 CFU/蘋果在儲存 24 周后減少。此外，與無臭氧氣體的 CA 儲存相比，在 CA 儲存中應用低劑量氣態(tài)臭氧可延緩常駐微生物群的生長，延緩蘋果硬度損失，改善蘋果品質，并且對 Red Delicious 蘋果的外部疾病沒有負面影響。因此，低劑量的連續(xù)氣態(tài)臭氧應用是蘋果行業(yè)控制李斯特菌的一個有前景的策略。和 Red Delicious 蘋果上的微生物腐爛。需要進一步研究不同臭氧用量和蘋果品種，以確保新鮮蘋果的安全和質量。